發(fā)布時間：2017-10-11
2017年9月20日，《eLife》期刊在線發(fā)表了題為《自由行為下幼年斑馬魚快速全腦神經(jīng)活動成像》的研究論文，該研究由中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心王凱研究組（神經(jīng)科學(xué)研究所）與溫泉研究組（中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)微尺度國家實(shí)驗(yàn)室）合作完成。該研究發(fā)展了一種新型三維在體成像技術(shù)——擴(kuò)增視場光場顯微技術(shù)（eXtended field-of-view Light Field Microscopy, XLFM），可以對斑馬魚幼體的全腦神經(jīng)元進(jìn)行高速神經(jīng)活動功能成像。研究團(tuán)隊(duì)將該成像技術(shù)與一套快速三維追蹤系統(tǒng)結(jié)合，成功實(shí)現(xiàn)了對自由行為下的幼年斑馬魚進(jìn)行快速全腦神經(jīng)元活動記錄，并首次捕捉到斑馬魚幼魚在捕食行為下高時空分辨率的全腦神經(jīng)活動。該研究打破了了長久以來神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域只能對頭部固定的活體斑馬魚進(jìn)行全腦功能神經(jīng)活動研究這一局限，為研究斑馬魚幼魚的感知運(yùn)動神經(jīng)環(huán)路提供了一種強(qiáng)有力的工具。
圖1. XLFM斑馬魚幼魚全腦成像。（a）XLFM示意圖。微透鏡陣列與物鏡的后光瞳平面共軛。激發(fā)光為470 nm的藍(lán)色激光。（b-c）不同豎直位置的點(diǎn)在相機(jī)上形成不同形狀的圖像，這些二維圖像編碼了物體的三維信息。（d）全腦細(xì)胞核標(biāo)記GCaMP6f（huc：h2b-gcamp6f）的斑馬魚幼魚的全腦最大強(qiáng)度投影（MIP）。（e）在t=0時刻光刺激后斑馬魚幼魚不同神經(jīng)元的熒光活動圖，根據(jù)神經(jīng)元的響應(yīng)時間先后順序進(jìn)行排序。（f）（e）中的選定的神經(jīng)元根據(jù)其響應(yīng)的起始時間被標(biāo)記了不同的顏色。刻度為100微米。
系統(tǒng)神經(jīng)科學(xué)的一個中心目標(biāo)就是理解動物的神經(jīng)環(huán)路活動與行為之間的聯(lián)系。近年涌現(xiàn)的一批光學(xué)手段（例如鈣信號熒光成像、光遺傳學(xué)等）已經(jīng)在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域取得了巨大的成功。在此過程中，斑馬魚幼魚因其體積小、光學(xué)透明、行為豐富等特征成為一種理想的模式動物。而光片顯微技術(shù)（light-sheet microscopy）、雙光子顯微技術(shù)（two-photon microscopy）已經(jīng)在揭示斑馬魚行為神經(jīng)環(huán)路機(jī)制上顯示出了強(qiáng)大的潛力。
然而，現(xiàn)有的斑馬魚全腦神經(jīng)活動的記錄都是在頭部固定的活體斑馬魚上完成的。雖然近年發(fā)展的虛擬現(xiàn)實(shí)技術(shù)（virtual reality）可以通過監(jiān)測斑馬魚運(yùn)動神經(jīng)信號并在斑馬魚周圍實(shí)時反饋相應(yīng)的虛擬圖像來模擬自由運(yùn)動的場景，但是這種技術(shù)無法模擬一些較復(fù)雜的行為，例如捕食行為。更重要的是，在虛擬現(xiàn)實(shí)中，斑馬魚的本體反饋被忽略，而這些本體反饋在感知運(yùn)動行為中扮演著重要角色。因此，發(fā)展一套適用于自由行為下的斑馬魚幼魚全腦神經(jīng)活動記錄的系統(tǒng)成為斑馬魚研究領(lǐng)域一個急迫的任務(wù)。
在此之前，自由行為下的全腦成像技術(shù)已經(jīng)在其他小型動物例如秀麗線蟲上實(shí)現(xiàn)。然而，由于斑馬魚幼魚運(yùn)動時的加速度和速度極快，準(zhǔn)確快速地對其腦部實(shí)現(xiàn)三維實(shí)時追蹤無論是對系統(tǒng)硬件還是算法上都提出了很高的要求。此外，由于斑馬魚全腦的體積相對較大，如何在斑馬魚運(yùn)動情況下實(shí)現(xiàn)對全腦的快速成像也是一個新的挑戰(zhàn)。對此，研究團(tuán)隊(duì)從兩方面入手。一方面，他們開發(fā)了一套高速三維追蹤系統(tǒng)，成功解決了對快速運(yùn)動的斑馬魚頭部實(shí)時追蹤的問題。在追蹤系統(tǒng)中，他們分別利用高速相機(jī)和一組特殊設(shè)計(jì)微透鏡實(shí)時監(jiān)測斑馬魚頭部的水平和豎直位置，并將此位置反饋給高速位移臺和壓電陶瓷做水平與豎直方向的位置校正。另一方面，針對成像方法，他們創(chuàng)造性地發(fā)展出了一種新型體成像技術(shù)——擴(kuò)增視場光場顯微技術(shù)（XLFM）。該技術(shù)利用一組放置在成像系統(tǒng)傅立葉平面上的微透鏡陣列，可以同時將物體不同方向的投影成像到相機(jī)上，相機(jī)采集到的圖像經(jīng)過特殊算法重構(gòu)物體的三維信息。該成像方法不僅成像速度極快，可以以77 Hz的速度記錄斑馬魚幼魚的全腦活動，而且相較之前的體成像技術(shù)，空間分辨率得到了大幅提高，達(dá)到了3.4 μm × 3.4 μm × 5 μm，在斑馬魚全腦中已經(jīng)接近單細(xì)胞分辨率。至此，該工作成功解決了斑馬魚幼魚的追蹤與成像這兩大問題。
進(jìn)一步地，他們將XLFM與高速三維追蹤系統(tǒng)結(jié)合，成功捕捉到了斑馬魚幼魚捕食行為下的全腦活動。斑馬魚的捕食行為由于涉及動機(jī)、感知、決策、運(yùn)動控制、反饋等一系列復(fù)雜的神經(jīng)環(huán)路功能，一直以來都受到神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)關(guān)注。然而，長久以來，人們受限于研究工具一直無法深入研究捕食行為背后的神經(jīng)環(huán)路機(jī)制。而該工作的完成恰恰填補(bǔ)了這一缺陷，這將極大地促進(jìn)對斑馬魚幼魚捕食等復(fù)雜行為神經(jīng)機(jī)理的研究，對人們更好地理解感知運(yùn)動相關(guān)的神經(jīng)環(huán)路工作機(jī)理具有重要意義。該技術(shù)進(jìn)一步拓展后亦可大規(guī)模監(jiān)測其他小型動物神經(jīng)系統(tǒng)的活動。
圖2. 捕食行為中的斑馬魚幼魚全腦成像。（a）在捕食行為中的6個關(guān)鍵時間點(diǎn)的全腦活動（上圖）和對應(yīng)的低被行為（下圖）。用于定量分析行為的一些參數(shù)包括：斑馬魚-草履蟲夾角、兩眼會聚角、頭部朝向、斑馬魚-草履蟲距離d。（b）全神經(jīng)系統(tǒng)胞質(zhì)GCaMP6s表達(dá)的斑馬魚全腦最大強(qiáng)度投影（MIP），四個感興趣的腦區(qū)的邊界已經(jīng)被標(biāo)出。（c）根據(jù)熒光信號亮度得到的四個腦區(qū)在捕食過程中的神經(jīng)活動（上），以及對應(yīng)的行為參數(shù)的變化（中、下）。
該工作由中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心王凱研究員、杜久林研究員與溫泉研究員合作完成，神經(jīng)所助研叢林、杭葦、科大本科生王澤冠、博士生柴宇明為共同第一作者，王凱研究員、溫泉研究員為共同通訊作者，杜久林組副研究員尚春峰、王凱組研究生白璐和溫泉組研究生楊文斌也做出了重要貢獻(xiàn)。
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